Если Вы обнаружите ошибку, напишите нам в телеграм @omnichem или на почту e.urvanov@omnichem.ru
Обзор
Артемизия (ароматическое растение) представляет собой род растений, широко распространенных в умеренных регионах северного полушария, и многие культуры имеют долгую традицию использования этих растений в качестве активного вещества, экстрактов, косметики, специй и т. д. В настоящее время открытие нового сырья на основе растений для использования в качестве активных веществ (активов) или лекарств стимулируется развитием методов биопроспекции (в том числе для сбора активных компонентов, активов). Часто, основанные на знаниях, полученных из этноботанического использования растений, методы экстракции активных компонентов исследуют существующее биоразнообразие путем интеграции современных методов омики с целевыми биоактивными анализами.
Артемизия (ароматическое растение) представляет собой род растений, широко распространенных в умеренных регионах северного полушария, и многие культуры имеют долгую традицию использования этих растений в качестве активного вещества, экстрактов, косметики, специй и т. д. В настоящее время открытие нового сырья на основе растений для использования в качестве активных веществ (активов) или лекарств стимулируется развитием методов биопроспекции (в том числе для сбора активных компонентов, активов). Часто, основанные на знаниях, полученных из этноботанического использования растений, методы экстракции активных компонентов исследуют существующее биоразнообразие путем интеграции современных методов омики с целевыми биоактивными анализами.
В этой работе мы разработали план биопроспекции для исследования фитохимического разнообразия и потенциальной биоактивности пяти видов артемизии (полыни) с признанными этноботаническими традициями (A. absinthium, A. alba, A. annua, A. verlotiorum и A. vulgaris - виды полыни), растущих на дикой местности в природных зонах провинции Верона. Мы характеризовали специализированные метаболомы видов (включая сесквитерпены из пути создания экстракта из артемизии) с помощью нецелевого LC–MS подхода, и, чтобы выявить потенциальные биоактивные метаболиты (антиоксиданты), мы коррелировали их состав с витринной антиоксидантной активностью. Мы предлагаем в качестве потенциально биоактивных соединений несколько изомеров эфиров киновой кислоты с кофеоилом и ферулоилом (например, дикафеоилхиновые кислоты -- фенольные соединения, ферулоилхиновые кислоты и кофеоилферулоилхиновые кислоты), которые сильно характеризуют наиболее антиоксидантные виды A. verlotiorum и A. annua. Более того, в этом исследовании мы впервые сообщаем о наличии сесквитерпеноидов из способе создания экстракта из артемизии в виде A. alba.
Все эти подходы сильно ускоряют и улучшают производство косметического сырья для дальнейшего производства косметики
Ключевые слова: Artemisia spp., Биомимикрия, Антиоксиданты, Дикафеоилхиновые кислоты, Сесквитерпены, Артемизин, Метаболомика, Растительные науки, Сырьё, Активные ингридиенты, Полынь, Полынь горькая
В этой работе мы разработали план биопроспекции для исследования фитохимического разнообразия и потенциальной биоактивности пяти видов артемизии (полыни) с признанными этноботаническими традициями (A. absinthium, A. alba, A. annua, A. verlotiorum и A. vulgaris - виды полыни), растущих на дикой местности в природных зонах провинции Верона. Мы характеризовали специализированные метаболомы видов (включая сесквитерпены из пути создания экстракта из артемизии) с помощью нецелевого LC–MS подхода, и, чтобы выявить потенциальные биоактивные метаболиты (антиоксиданты), мы коррелировали их состав с витринной антиоксидантной активностью. Мы предлагаем в качестве потенциально биоактивных соединений несколько изомеров эфиров киновой кислоты с кофеоилом и ферулоилом (например, дикафеоилхиновые кислоты -- фенольные соединения, ферулоилхиновые кислоты и кофеоилферулоилхиновые кислоты), которые сильно характеризуют наиболее антиоксидантные виды A. verlotiorum и A. annua. Более того, в этом исследовании мы впервые сообщаем о наличии сесквитерпеноидов из способе создания экстракта из артемизии в виде A. alba.
Все эти подходы сильно ускоряют и улучшают производство косметического сырья для дальнейшего производства косметики
Ключевые слова: Artemisia spp., Биомимикрия, Антиоксиданты, Дикафеоилхиновые кислоты, Сесквитерпены, Артемизин, Метаболомика, Растительные науки, Сырьё, Активные ингридиенты, Полынь, Полынь горькая
Введение
Биопроспекция - это систематическое и организованное исследование (в том числе оценка антиоксидантной активности) природных растительные экстракты (ресурсов, в целом) и продуктов, полученных из микроорганизмов, растений, грибов и животных, эксплуатация которых имеет потенциал для создания значительных экономических и социальных выгод. Этот подход применяется уже веками людьми, которые всегда смотрели на растения как на ключевой источник ботанических лекарственных средств и других активных веществ для своего благополучия. В настоящее время около 25% препаратов, назначаемых в современной медицине, происходят от растений или являются экстрактами и синтетическими производными, полученными из молекулярных предшественников растительных экстрактов, в то время как значительная часть населения, проживающего в развивающихся странах, до сих пор полагается на традиционные растительные средства для основного здравоохранения. Однако недавняя литература оценивает, что только 15% видов, используемых для лечения заболеваний, были изучены с точки зрения их медицинского применения, что подчеркивает необходимость дополнительного поиска активных веществ.
Род Artemisia (семейство Астровые) включает около 500 видов трав и кустарников, которые являются двулетними, однолетними или многолетними и широко распространены в умеренных регионах Европы, Азии, Северной Африки и Северной Америки. В многих культурах несколько видов этого рода характеризуются давним этноботаническим использованием, включая приготовление травяных средств для лечения различных недугов, приготовление травяных чаев (с активными ингридиентами), спиртных напитков, тоников и косметики или выращивание как культурных растений. Многие недавние исследования раскрыли биологически активные вещества растительного сырья рода, сообщая о широком спектре биологической активности, отражающем огромное количество и разнообразие фитохимических активных веществ, найденных в каждом виде.
В этой работе мы разработали план биопроспекции на основе литературы местной флоры для исследования фитохимического разнообразия и потенциальной биологической активности пяти видов Artemisia с признанным этноботаническим наследием. Эти виды растут дикими в природных зонах провинции Верона и в региональном парке Лессиния, характеризующемся холмистыми и горными ландшафтами, где климат классифицируется как холодный без сухого сезона и теплым летом.
Род Artemisia (семейство Астровые) включает около 500 видов трав и кустарников, которые являются двулетними, однолетними или многолетними и широко распространены в умеренных регионах Европы, Азии, Северной Африки и Северной Америки. В многих культурах несколько видов этого рода характеризуются давним этноботаническим использованием, включая приготовление травяных средств для лечения различных недугов, приготовление травяных чаев (с активными ингридиентами), спиртных напитков, тоников и косметики или выращивание как культурных растений. Многие недавние исследования раскрыли биологически активные вещества растительного сырья рода, сообщая о широком спектре биологической активности, отражающем огромное количество и разнообразие фитохимических активных веществ, найденных в каждом виде.
В этой работе мы разработали план биопроспекции на основе литературы местной флоры для исследования фитохимического разнообразия и потенциальной биологической активности пяти видов Artemisia с признанным этноботаническим наследием. Эти виды растут дикими в природных зонах провинции Верона и в региональном парке Лессиния, характеризующемся холмистыми и горными ландшафтами, где климат классифицируется как холодный без сухого сезона и теплым летом.
Результаты и обсуждение
Метаболические профили метаноловых экстрактов Artemisia spp
Метанолические экстракты листьев и стеблей Artemisia spp. были произведены и проанализированы с помощью нецеленаправленного UPLC-ESI-MS, что привело к обнаружению 226 масс-зарядных характеристик в режиме отрицательной ионизации (Дополнительный файл 1) и к идентификации 80 вторичных метаболитов (активные ингредиенты). Последние перечислены в Таблице 2 вместе с их хроматографическими и спектральными характеристиками. Представительные хроматографические профили метаноловых экстрактов листьев и стеблей показаны на Рис. 2, вместе с круговыми диаграммами, отображающими состав метаболомов по процентному содержанию каждого класса метаболитов (активные ингредиенты) относительно общего сигнала LC-MS. Более того, для описания отдельных соединений, характеризующих различные виды Artemisia, в тепловой карте на Рис. 3 представлены относительные сравнения процентных содержаний всех идентифицированных метаболитов (активные ингредиенты), сгруппированных по соответствующему классу метаболитов (активные ингредиенты).
Основными специализированными метаболитами, составляющими метаболомы Artemisia spp., являются производные гидроксикоричных кислот (HCA), в основном кофейная и феруловая кислоты, дифференциально эстерифицированные с одним или несколькими органическими кислотными остатками, о-гликозидированные флавоноиды (в основном флавонолы и флавоны вместе с их о-метилированными производными), о-гликозидированные кумарины и несколько других метаболитов, идентифицированных как гликозиды гидроксибензойных кислот, лигнаны (активные ингридиенты), сапонины (растительные ингредиенты) и сесквитерпены. В целом был достигнут высокий уровень характеризации метаболома, что привело к аннотированию метаболитов в диапазоне от 85 до 97% от общего сигнала LC-MS, с A. annua и A. absinthium, являющимися видами с более высоким процентом неопознанных метаболитов. Дериваты HCA представляли самый обильный класс метаболитов, колеблющийся от 62 до 94% от общего сигнала LC-MS в A. absinthium и A. verlotiorum, соответственно. Как можно видеть на хроматограммах на Рис. 2, во всех пяти видах этот класс был доминирован кофейными кислотными эфирами хининовой кислоты, в частности двумя изомерами кофейной кислоты (соединениями 9, 15) и множеством изомеров дикаффеоилхининовой кислоты (28, 33, 34, 37, 38, 40, 41). Предварительно аннотированные метаболиты включают дикофеиновую кислоту (28, 33, 34, 37, 38, 40, 41).
В процессе исследования были изучены метаболиты пяти видов рода Artemisia, а именно A. absinthium, A. alba, A. annua, A. verlotiorum и A. vulgaris. Органы растений - листья и стебли - были подвергнуты анализу на содержание различных соединений с использованием методики жидкостной хроматографии масс-спектрометрии (LC-MS). В результате обнаружено, что у каждого вида Artemisia имеется свой характерный профиль метаболитов.
A. absinthium и A. alba выделяются наличием гликозидов различных кумаринов, а также кафеоилкининовых кислот. В A. alba было выявлено также высокое содержание тубероновой кислоты, относящейся к классу гликозидов ясмонатов. A. annua характеризуется большим разнообразием метаболитов, включая гидроксикоричные кислоты и их эфиры, а также флавоноиды. В A. verlotiorum обнаружены линганы, сапонины (растительные ингредиенты) и терпены, а также разнообразные кафеиновые кислоты. A. vulgaris отличается наличием сапонинов, дикофеиновых кислот и дигидроксибензойных кислот.
Антиоксидантные анализы Artemisia spp. метанольные экстракты
В данной работе были проведены ин витро антиоксидантные анализы для выявления потенциальных источников антиоксидантов среди пяти видов растений рода Artemisia. Были использованы FRAP и DPPH анализы для оценки способности экстрактов листьев и стеблей к уменьшению и квантификации свободных радикалов соответственно.
В целом, экстракты из листьев показали более высокую антиоксидантную активность по сравнению с экстрактами из стеблей в обоих анализах. Среди пяти видов, A. absinthium показал наименьшую антиоксидантную активность, в то время как A. verlotiorum проявил самую высокую антиоксидантную мощность.
Было обнаружено, что активность антиоксидантов может варьироваться в зависимости от сезона сбора растений. Например, у A. verlotiorum была выше антиоксидантная активность в 2021 году по сравнению с 2019 и 2020 годами, в то время как у A. annua и A. vulgaris антиоксидантная активность была ниже в 2019 году.
Был проведен анализ корреляции между антиоксидантной активностью и метаболическими профилями растений с использованием метода многомерного анализа OPLS. Полученные данные показали, что высокую антиоксидантную активность у всех видов растений обуславливают гидроксициннаматы, эфирные кислоты киновой кислоты и флавоноиды, особенно различные изомеры дикафеоилхиновой кислоты.
Таким образом, растения Artemisia spp. могут представлять собой ценный источник биологически активных соединений, таких как гидроксициннаматы и флавоноиды, которые обладают антиоксидантными свойствами и могут иметь потенциальные медицинские применения.
В целом, экстракты из листьев показали более высокую антиоксидантную активность по сравнению с экстрактами из стеблей в обоих анализах. Среди пяти видов, A. absinthium показал наименьшую антиоксидантную активность, в то время как A. verlotiorum проявил самую высокую антиоксидантную мощность.
Было обнаружено, что активность антиоксидантов может варьироваться в зависимости от сезона сбора растений. Например, у A. verlotiorum была выше антиоксидантная активность в 2021 году по сравнению с 2019 и 2020 годами, в то время как у A. annua и A. vulgaris антиоксидантная активность была ниже в 2019 году.
Был проведен анализ корреляции между антиоксидантной активностью и метаболическими профилями растений с использованием метода многомерного анализа OPLS. Полученные данные показали, что высокую антиоксидантную активность у всех видов растений обуславливают гидроксициннаматы, эфирные кислоты киновой кислоты и флавоноиды, особенно различные изомеры дикафеоилхиновой кислоты.
Таким образом, растения Artemisia spp. могут представлять собой ценный источник биологически активных соединений, таких как гидроксициннаматы и флавоноиды, которые обладают антиоксидантными свойствами и могут иметь потенциальные медицинские применения.
Ищем новый источник артемизинина
Для фармацевтической индустрии очень важным является сесквитерпеновый лактон артемисинин и его полусинтетические производные из-за их антималарийных свойств. Артемисинин, извлеченный из растений A. annua, за короткое время приобрел статус наиболее эффективного антималарийного препарата, и недавно появились новые данные о его многочисленных других биологических свойствах, таких как антираковое, противовоспалительное и противовирусное. Именно поэтому возник большой интерес к поиску экотипов A. annua, богатых артемисинином, и к манипулированию их биосинтетическим путем с помощью различных биотехнологических методов. Кроме того, поскольку антималарийная активность была зарегистрирована для различных видов рода Artemisia, были проведены многие исследования с целью поиска альтернативных естественных источников артемисинина внутри этого рода. Несмотря на то что артемисинин, как известно, присутствует в разных количествах в таких видах, как A. dubia, A. scoparia, A. cina, A. vachanica, A. dracunculus, A. verlotiorum и A. vulgaris, основным источником этого метаболита остается A. annua.
В данной работе была исследована способность растений рода Artemisia, собранных в провинции Верона, производить антималарийный лекарственный препарат артемисинин и смежные соединения из его биосинтетического пути. Для этого был проведен анализ методом жидкостной хроматографии масс-спектрометрии в положительном режиме и искались конечные продукты пути (артемисинин и артеанин В) и их непосредственные предшественники (дигидроартемисиновая кислота и артемисиновая кислота соответственно). Их идентификация была осуществлена путем сравнения значений m/z, фрагментационных шаблонов и времени удерживания с соответствующими эталонными образцами. Относительное сравнение их уровней в листьях пяти видов Artemisia представлено на графике.
Из результатов исследования следует, что только у A. annua обнаруживается обнаруживается детектируемый уровень артемисинина. Тем не менее, предшественник артемисинина, дигидроартемисиновая кислота, присутствует не только в A. annua, но и в A. alba и A. verlotiorum. Артеанин В, конечный метаболит параллельного пути, исходящего от артемисинового альдегида, обнаружен в больших количествах в A. annua и в значительно меньших количествах в A. absinthium и A. alba, но отсутствует в A. verlotiorum. Предшественник как артеанина В, так и артемисинина, артемисиновая кислота, присутствует в A. annua, что соответствует ожиданиям, но не обнаружено в A. absinthium и A. alba. A. vulgaris не производит ни одного из метаболитов из выбранного пути.
Таким образом, несмотря на то что следов артемисинина не было обнаружено, присутствие предшественника дигидроартемисиновой кислоты и побочного продукта пути, артеанина В, указывает на то, что гены биосинтетического пути артемисинина экспрессируются в этих растениях. Гипотеза о том, что биосинтетический путь артемисинина может быть анцестральной характеристикой, совместно разделяемой многими растениями в роде Artemisia, получила подтверждение в недавних отчетах, подтверждающих экспрессию структурных генов у восьми видов Artemisia, включая A. absinthium и A. vulgaris. Их уровни экспрессии зависели от органа сбора и рассматриваемой фазы развития, и их соотношение и оборот были важны для определения потока промежуточных продуктов через две ветви пути, ведущие к накоплению артемисинина или артеанина В. Тем не менее, сложность физиологического контекста, связанного с накоплением артемисинина, требует учета других факторов для объяснения большой изменчивости, наблюдаемой в производстве артемисинина и смежных метаболитов.
В данной работе была исследована способность растений рода Artemisia, собранных в провинции Верона, производить антималарийный лекарственный препарат артемисинин и смежные соединения из его биосинтетического пути. Для этого был проведен анализ методом жидкостной хроматографии масс-спектрометрии в положительном режиме и искались конечные продукты пути (артемисинин и артеанин В) и их непосредственные предшественники (дигидроартемисиновая кислота и артемисиновая кислота соответственно). Их идентификация была осуществлена путем сравнения значений m/z, фрагментационных шаблонов и времени удерживания с соответствующими эталонными образцами. Относительное сравнение их уровней в листьях пяти видов Artemisia представлено на графике.
Из результатов исследования следует, что только у A. annua обнаруживается обнаруживается детектируемый уровень артемисинина. Тем не менее, предшественник артемисинина, дигидроартемисиновая кислота, присутствует не только в A. annua, но и в A. alba и A. verlotiorum. Артеанин В, конечный метаболит параллельного пути, исходящего от артемисинового альдегида, обнаружен в больших количествах в A. annua и в значительно меньших количествах в A. absinthium и A. alba, но отсутствует в A. verlotiorum. Предшественник как артеанина В, так и артемисинина, артемисиновая кислота, присутствует в A. annua, что соответствует ожиданиям, но не обнаружено в A. absinthium и A. alba. A. vulgaris не производит ни одного из метаболитов из выбранного пути.
Таким образом, несмотря на то что следов артемисинина не было обнаружено, присутствие предшественника дигидроартемисиновой кислоты и побочного продукта пути, артеанина В, указывает на то, что гены биосинтетического пути артемисинина экспрессируются в этих растениях. Гипотеза о том, что биосинтетический путь артемисинина может быть анцестральной характеристикой, совместно разделяемой многими растениями в роде Artemisia, получила подтверждение в недавних отчетах, подтверждающих экспрессию структурных генов у восьми видов Artemisia, включая A. absinthium и A. vulgaris. Их уровни экспрессии зависели от органа сбора и рассматриваемой фазы развития, и их соотношение и оборот были важны для определения потока промежуточных продуктов через две ветви пути, ведущие к накоплению артемисинина или артеанина В. Тем не менее, сложность физиологического контекста, связанного с накоплением артемисинина, требует учета других факторов для объяснения большой изменчивости, наблюдаемой в производстве артемисинина и смежных метаболитов.
Экспериментальная секция
Растительный материал
В течение трех сезонов роста 2019, 2020 и 2021 годов было независимо отобрано пять видов растений рода Artemisia на трех холмах и горных районах в провинции Верона. После идентификации растениям были присвоены штрих-коды, и в музее естественной истории Вероны имеется образец каждого вида. Все процедуры отбора образцов проводились в соответствии с рекомендациями.
На каждом месте отбора образцов растения собирались с трех различных точек (т.е. три различных популяции растений, представляющих три биологических повторения), достаточно далеко друг от друга, чтобы избежать отбора растительных популяций, происходящих от одного источника генетической информации. Для каждого повторения листья и стебли собирались у не менее чем 5 особей и объединялись в соответствии с органом. Образцы немедленно замораживались в сухом льду, а затем хранились при температуре -80 °C. Замороженный растительный материал измельчался в жидком азоте с использованием мельницы IKA A11 basic.
На каждом месте отбора образцов растения собирались с трех различных точек (т.е. три различных популяции растений, представляющих три биологических повторения), достаточно далеко друг от друга, чтобы избежать отбора растительных популяций, происходящих от одного источника генетической информации. Для каждого повторения листья и стебли собирались у не менее чем 5 особей и объединялись в соответствии с органом. Образцы немедленно замораживались в сухом льду, а затем хранились при температуре -80 °C. Замороженный растительный материал измельчался в жидком азоте с использованием мельницы IKA A11 basic.
Химические вещества и реагенты
Стандарт артемизинина был приобретен у Sigma-Aldrich (Сент-Луис, США). Стандарты артеаннуина B и артемизиновой кислоты были приобретены у Biosynth® Carbosynth (Братислава, Словакия). Стандарт дигидроартемизиновой кислоты был приобретен у Toronto Reasearch Chemical (Торонто, Канада). Метанол, ацетонитрил и вода (все LC–MS качества) были приобретены у Honeywell (Шарлотт, США). Муравьиная кислота (LC–MS качества) была приобретена у Biosolve Chimie (Диез, Франция). Трелокс и DPPH были приобретены, соответственно, у Sigma-Aldrich и Thermo Fisher Scientific.
Экстракция метаболитов
100 мг замороженного порошка экстрагировали в 1,5 мл метанола, интенсивно перемешивали в течение 30 секунд, затем помещали в ультразвуковую ванну Sonica® Ultrasonic Cleaner при 4 °C на 15 мин и центрифугировали (16 000 об/мин, 15 мин, 4 °C). Сверхнатанты были разбавлены в 100% метаноле. Прямо перед анализом образцы разбавляли в 1:2 (V:V) с очищенной водой. Затем смеси фильтровали через минифильтры Minisart RC4 (0,2 мкм поры) и вводили 1 мкл в устройство UPLC.
Анализ UPLC–ESI–MS
Была использована система Acquity I Class UPLC (Waters, Милфорд, США) с колонкой BEH C18 (Waters), онлайн связанной с PDA (фотодиодный детектор) и масс-спектрометром Xevo G2-XS qTOF (Waters), оборудованным ионизационным источником электроспрея (ESI). Экстракты инъецировались через охлаждаемый автосэмплер (8 °C), и использовалась скорость потока 0,350 мл/мин. Мобильные фазы были 0,1% муравьиной кислоты в воде (раствор A) и ацетонитрил (раствор B), а градиент элюции был следующим: 0–1 мин, 1% B; 1–10 мин, 1–40% B; 10–13,50 мин, 40–70% B; 13,50–15,00 мин, 70–90% B; 15,00–16,50 мин, 90–100% B; 16,50–20 мин 100% B; 20–20,1, 100–1% B; 20,1–25 мин, 1% B (начальные условия).
Sequence was randomized. Quality control (QC), подготовленный путем смешивания равных частей всех экстрактов, анализировался в течение всего эксперимента каждые десять анализов образцов. Параметры ионного источника были следующими: напряжение капилляра 0,8 кВ, напряжение отбора проб 40 В, смещение источника 80 В, температура источника 120 °C, температура десорбции 500 °C, скорость потока газа конуса 50 л/ч и скорость потока газа десорбции 1000 л/ч. Для небулайзера использовался азот, а для десорбции - аргон. MS-данные получались в непрерывном режиме в положительном и отрицательном режимах ионизации в диапазоне 50–2000 масс/заряд с фиксированной энергией столкновения 35 В. Данные получались с помощью программного обеспечения Mass Lynx v4.2 (Waters).
Sequence was randomized. Quality control (QC), подготовленный путем смешивания равных частей всех экстрактов, анализировался в течение всего эксперимента каждые десять анализов образцов. Параметры ионного источника были следующими: напряжение капилляра 0,8 кВ, напряжение отбора проб 40 В, смещение источника 80 В, температура источника 120 °C, температура десорбции 500 °C, скорость потока газа конуса 50 л/ч и скорость потока газа десорбции 1000 л/ч. Для небулайзера использовался азот, а для десорбции - аргон. MS-данные получались в непрерывном режиме в положительном и отрицательном режимах ионизации в диапазоне 50–2000 масс/заряд с фиксированной энергией столкновения 35 В. Данные получались с помощью программного обеспечения Mass Lynx v4.2 (Waters).
Обработка LC–MS данных и идентификация метаболитов
Хроматограммы в отрицательном ионизационном режиме обрабатывались с помощью программного обеспечения Progenesis QI (Waters) для получения матрицы квантования характеристик (FQM; Supplementary File 1).
Антиоксидантные анализы
Те же метаноловые экстракты, использованные для анализа UPLC-ESI–MS, использовались для определения антиоксидантной активности in vitro методами FRAP и DPPH в прозрачных 96-луночных микропланшетах.
Раствор FRAP готовили, смешивая в соотношении 10:1:1 (V:V:V) следующие реагенты: буфер FRAP (3,1 г/л тригидрата ацетата натрия, 16 мл/л уксусной кислоты pH 3,6), 10 мМ TPTZ (2,4,6-три(2-пиридил)-1,2,5-триазин) в HCl 40 мМ, FeCl3 * 6H2O 20 мМ. Тест проводили, смешивая 200 µл раствора FRAP с 20 µл образца, или растворов Трелокса различной концентрации или метанола (бланк). Метаноловые экстракты образцов разбавляли в соотношении 1:20 для листьев и в диапазоне от 1:3 до 1:10 для стеблей. Каждый образец тестировали в трех технических повторах. Микропланшета инкубировалась при 37 °C в темноте в течение 15 мин, затем охлаждали до комнатной температуры в течение 4 мин. Поглощение измеряли при 593 нм с использованием планшетного считывателя Infinite 200 PRO (Tecan).
1 мМ DPPH стоковый раствор готовили непосредственно в метаноле не менее чем за 2 часа до анализа. Рабочий раствор 100 мкМ готовили, разбавляя раствор DPPH в соотношении 1:10 (V:V) в 70% метаноле. 200 µл раствора DPPH добавляли к 20 µл образца, то есть разбавленных растительных экстрактов или растворов Трелокса различной концентрации или метанола (бланк). Метаноловые экстракты разбавляли в диапазоне от 1:10 до 1:20 и от 1:3 до 1:10 для листьев и стеблей, соответственно. Каждый образец тестировали в трех технических повторах. Микропланшета инкубировалась при 25 °C в темноте в течение 30 мин, затем поглощение измеряли при 517 нм с использованием планшетного считывателя Infinite 200 PRO (Tecan).
В качестве референсного антиоксиданта использовался компонент Трелокс, водорастворимый аналог витамина Е, для выражения антиоксидантной активности растительных экстрактов в виде эквивалентов Трелокса (TEAC), единица которого составляет ммоль эквивалента Трелокса на килограмм (ммоль/кг). К 200 мкл раствору FRAP или DPPH добавляли 20 мкл растворов Трелокса с концентрациями от 500 до 5 мкМ для составления калибровочной кривой Трелокса в каждом анализе.
Раствор FRAP готовили, смешивая в соотношении 10:1:1 (V:V:V) следующие реагенты: буфер FRAP (3,1 г/л тригидрата ацетата натрия, 16 мл/л уксусной кислоты pH 3,6), 10 мМ TPTZ (2,4,6-три(2-пиридил)-1,2,5-триазин) в HCl 40 мМ, FeCl3 * 6H2O 20 мМ. Тест проводили, смешивая 200 µл раствора FRAP с 20 µл образца, или растворов Трелокса различной концентрации или метанола (бланк). Метаноловые экстракты образцов разбавляли в соотношении 1:20 для листьев и в диапазоне от 1:3 до 1:10 для стеблей. Каждый образец тестировали в трех технических повторах. Микропланшета инкубировалась при 37 °C в темноте в течение 15 мин, затем охлаждали до комнатной температуры в течение 4 мин. Поглощение измеряли при 593 нм с использованием планшетного считывателя Infinite 200 PRO (Tecan).
1 мМ DPPH стоковый раствор готовили непосредственно в метаноле не менее чем за 2 часа до анализа. Рабочий раствор 100 мкМ готовили, разбавляя раствор DPPH в соотношении 1:10 (V:V) в 70% метаноле. 200 µл раствора DPPH добавляли к 20 µл образца, то есть разбавленных растительных экстрактов или растворов Трелокса различной концентрации или метанола (бланк). Метаноловые экстракты разбавляли в диапазоне от 1:10 до 1:20 и от 1:3 до 1:10 для листьев и стеблей, соответственно. Каждый образец тестировали в трех технических повторах. Микропланшета инкубировалась при 25 °C в темноте в течение 30 мин, затем поглощение измеряли при 517 нм с использованием планшетного считывателя Infinite 200 PRO (Tecan).
В качестве референсного антиоксиданта использовался компонент Трелокс, водорастворимый аналог витамина Е, для выражения антиоксидантной активности растительных экстрактов в виде эквивалентов Трелокса (TEAC), единица которого составляет ммоль эквивалента Трелокса на килограмм (ммоль/кг). К 200 мкл раствору FRAP или DPPH добавляли 20 мкл растворов Трелокса с концентрациями от 500 до 5 мкМ для составления калибровочной кривой Трелокса в каждом анализе.
Статистический анализ
Данные FQM и антиоксидантной активности (значения TEAC) анализировались с помощью программного обеспечения SIMCA-P (Umetrics, Швеция) для многомерного статистического анализа с целью выявления взаимосвязей между in-vitro антиоксидантной активностью растительных экстрактов и их составом метаболитов. Функции масс/заряд (т.е. метаболиты) набора данных были присвоены как X-переменные (шкалирование Парето), а активность антиоксиданта - как Y-переменные (шкалирование UV). Использовался метод ортогональной частичной наименьших квадратов (OPLS). Метаболиты, предположительно ответственные за антиоксидантную активность, были идентифицированы путем анализа загруженности столбца; только метаболиты, показывающие значение pq(corr) > 0,8 (произвольный порог), считались коррелирующими с антиоксидантной активностью. Все статистические расчеты проводились с использованием программного обеспечения GraphPad Prism версии 8.0 (GraphPad Software, Сан-Диего, Калифорния, США). Все значения средних ± SD (n = 3) указаны на графиках. Статистический анализ проводился с использованием одно- или двухстороннего анализа дисперсии, за которым следовал тест Тьюки.
