Если Вы обнаружите ошибку, напишите нам в телеграм @omnichem или на почту e.urvanov@omnichem.ru
В данном исследовании мы оценили терапевтические свойства экстракта Erigeron annuus (EA) без корней (EEA) и его основного компонента - пиромеконовой кислоты (PA), сосредотачиваясь на их антигистаминном, противовоспалительном и антиоксидантном потенциале с использованием клеток HMC-1 (человеческих мастоцитов) и кератиноцитов человека (клеток HaCaT). Наши результаты показали, что секреция гистамина, тесно связанная с зудом, заметно снижалась у клеток HMC-1 после предварительной обработки EEA (0,1% и 0,2%) и PA (соответствующая концентрация, 4,7 или 9,4 мкг/мл). Аналогично, они привели к заметному снижению уровней противовоспалительных цитокинов, включая IL-1β, IL-8, IL-6 и IFN-γ. Кроме того, EA и PA усилили активность антиоксидантных ферментов, таких как супероксиддисмутаза (SOD) и каталаза (CAT), снизили производство малондиальдегида (MDA) и проявили активность по поглощению реактивных форм кислорода (ROS) в клетках HaCaT. Более того, на молекулярном уровне повышенные уровни противовоспалительных цитокинов IL-1β, IL-6, TARC и MDC, индуцированные TNF-α/IFN-γ в клетках HaCaT, были смягчены при обработке EEA и PA. Мы также выявили защитные эффекты EEA и PA от дисфункции кожного барьера, индуцированной SDS, в клетках HaCaT путем улучшения экспрессии барьерных белков. Используя технологию NanoString, обширный анализ изменений экспрессии генов показал значительную модуляцию аутоиммунных и воспалительных генов EEA и PA. В заключение, это исследование предполагает, что EEA и соответствующая концентрация PA как активного ингредиента имеют функциональные косметические применения для облегчения зуда и улучшения состояния кожи.
Ключевые слова: Клеточная биология, Здравоохранение
Ключевые слова: Клеточная биология, Здравоохранение
Введение
Кожные воспаления и зуд - это постоянное и беспокоящее состояние, характеризующееся покраснением и отеком, и ассоциируется с кожными заболеваниями, такими как псориаз, экзема и атопический дерматит. Частое чесание в ответ на зуд нарушает защитный барьер кожи, способствует воспалению и может привести к вторичным бактериальным инфекциям. Это приводит к «циклу зуда-чесания», при котором непрерывное нарушение защитного барьера кожи и ослабление иммунной функции создают цикл, приводящий к ухудшению состояния кожи. Топические кортикостероиды и антигистаминные препараты широко используются для лечения воспаления и зуда. Однако их эффективность в контроле не-гистаминового зуда ограничена, а длительное применение может вызвать побочные эффекты, такие как атрофия кожи, гиперпигментация и телеангиэктазии. Поэтому важно разрабатывать растительные лекарственные средства, способные эффективно управлять состоянием кожи и обеспечивать безопасное и стабильное облегчение от зуда и воспаления.
Мастоциты играют ключевую роль в аллергических реакциях и воспалении, запасая и высвобождая различные посредники, включая цитокины, такие как гистамин и интерферон-гамма (IFN-γ). Гистамин также оказывает различные иммунорегуляторные функции, модулируя функции моноцитов, Т-клеток, макрофагов, нейтрофилов, эозинофилов, В-клеток и дендритных клеток. Кератиноциты, преобладающие клетки в эпидермисе, вносят свой вклад в увлажнение кожи и регулируют иммунные ответы, вырабатывая разнообразные хемокины и цитокины. Кожные расстройства, такие как атопический дерматит, псориаз и ихтиоз, характеризующиеся воспалением и зудом, часто связаны с дисбалансом иммунной системы типа Th1/Th2, вызванным веществами, выделяемыми мастоцитами и кератиноцитами во время воспалительного ответа. Таким образом, поддержание иммунной гомеостаза и защита защитного барьера кожи являются основой для сохранения здоровья кожи.
Эригерон однолетний (EA), также известный как ежегодный лебедник, традиционно используется для лечения различных расстройств, таких как энтерит, благодаря своему богатому химическому составу, включая флавоноиды и кумарины. Недавние исследования демонстрируют антиоксидантную и ингибирующую фермент активность кофейной кислоты и пиромеконной кислоты, активных соединений в EA, и выявили несколько фенольных кислот, активирующих путь AMPK и обладающих антиадипозными свойствами у мышей, вызванных ожирением на HFD. Кроме того, Джу и коллеги предположили, что 70% этаноловый экстракт EA значительно ингибирует тирозиназу и эластазу, способствуя антивозрастным свойствам, осветляя кожу и предотвращая образование морщин. Несмотря на эти преимущества, недостаточно исследований о пользе этого травяного средства для кожи в снижении воспаления. Однако есть несколько сообщений о противовоспалительном и защитном эффектах кожного барьера водного экстракта EA и пиромеконной кислоты (PA). Поэтому мы оценили лечебные свойства экстракта EA без корней (EEA) и его основного активного соединения, пиромеконной кислоты (PA), сосредотачиваясь на их антигистаминных, противовоспалительных и антиоксидантных способностях, используя HMC-1 (человеческие мастоциты) и кератиноциты человека (клетки HaCaT).
Мастоциты играют ключевую роль в аллергических реакциях и воспалении, запасая и высвобождая различные посредники, включая цитокины, такие как гистамин и интерферон-гамма (IFN-γ). Гистамин также оказывает различные иммунорегуляторные функции, модулируя функции моноцитов, Т-клеток, макрофагов, нейтрофилов, эозинофилов, В-клеток и дендритных клеток. Кератиноциты, преобладающие клетки в эпидермисе, вносят свой вклад в увлажнение кожи и регулируют иммунные ответы, вырабатывая разнообразные хемокины и цитокины. Кожные расстройства, такие как атопический дерматит, псориаз и ихтиоз, характеризующиеся воспалением и зудом, часто связаны с дисбалансом иммунной системы типа Th1/Th2, вызванным веществами, выделяемыми мастоцитами и кератиноцитами во время воспалительного ответа. Таким образом, поддержание иммунной гомеостаза и защита защитного барьера кожи являются основой для сохранения здоровья кожи.
Эригерон однолетний (EA), также известный как ежегодный лебедник, традиционно используется для лечения различных расстройств, таких как энтерит, благодаря своему богатому химическому составу, включая флавоноиды и кумарины. Недавние исследования демонстрируют антиоксидантную и ингибирующую фермент активность кофейной кислоты и пиромеконной кислоты, активных соединений в EA, и выявили несколько фенольных кислот, активирующих путь AMPK и обладающих антиадипозными свойствами у мышей, вызванных ожирением на HFD. Кроме того, Джу и коллеги предположили, что 70% этаноловый экстракт EA значительно ингибирует тирозиназу и эластазу, способствуя антивозрастным свойствам, осветляя кожу и предотвращая образование морщин. Несмотря на эти преимущества, недостаточно исследований о пользе этого травяного средства для кожи в снижении воспаления. Однако есть несколько сообщений о противовоспалительном и защитном эффектах кожного барьера водного экстракта EA и пиромеконной кислоты (PA). Поэтому мы оценили лечебные свойства экстракта EA без корней (EEA) и его основного активного соединения, пиромеконной кислоты (PA), сосредотачиваясь на их антигистаминных, противовоспалительных и антиоксидантных способностях, используя HMC-1 (человеческие мастоциты) и кератиноциты человека (клетки HaCaT).
Результаты исследования пиромеконовой кислоты в Erigeron annuus
Количественный анализ распределения пиромеконовой кислоты в Erigeron annuus
Для оптимизации получения пиромеконовой кислоты (PA) мы сравнили содержание PA в различных частях E. annuus и оценили различные методы извлечения. Уровень PA в различных надземных частях E. annuus был количественно проанализирован. В состав этих частей входили стебель, черешок листа, лист, соцветие и цветок (лепестки). Концентрации PA в каждом компоненте были определены следующим образом: цветок (10,745 мг/г EA), соцветие (15,944 мг/г), листья (20,000 мг/г), черешки листьев (10,507 мг/г) и стебли (16,349 мг/г). Эти результаты свидетельствуют о однородном распределении PA во всех надземных частях растения. Мы исследовали содержание PA в EEA при трех различных условиях извлечения. Результаты показали, что наивысший выход PA был получен при экстракции холодной водой при 30 °C. Следовательно, для получения наивысшей концентрации активных соединений EEA был получен водным экстрактом при 30 °C, используя всю надземную часть растения, исключая корни. Эти экстракты использовались в последующих экспериментах.
Оценка антиоксидантной активности EEA и PA
Для оценки антиоксидантной способности экстракта EEA были проведены анализы свободного радикала DPPH и ABTS. EEA и PA продемонстрировали значительную антиоксидантную активность по сравнению с аскорбиновой кислотой. EEA характеризовался значением IC50 0,343 ± 0,018% и PA показал IC50 15,70 ± 1,186 мкг/мл (эквивалентная концентрация, 0,33% EEA). В анализе ABTS EEA продемонстрировал умеренную антиоксидантную активность по сравнению с Троксолом, с IC50 1,187 ± 0,066%, и общее фенольное содержание в EEA было определено как 30,41 ± 0,45 мг GAE/г, по сравнению с галловой кислотой. Кроме того, PA показал IC50 17,96 ± 0,066 мкг/мл (эквивалентная концентрация, 0,38% EEA) в анализе ABTS и был измерен как 0,486 ± 0,01 мг GAE/г по сравнению с галловой кислотой. Заметно, что EEA проявил увеличение способности к антиоксидантной активности DPPH и ABTS в зависимости от дозы, указывая на его мощную и прогрессивную эффективность в борьбе с окислительным стрессом.
Усиленные антиоксидантные эффекты EEA и PA в клетках HaCaT при индуцированном H2O2 окислительном стрессе
Антиоксиданты играют ключевую роль в управлении кожными заболеваниями, нейтрализуя окислительный стресс, который может привести к повреждению клеток кожи и ингибированию дегрануляции мастоцитов, вызывая высвобождение гистамина и аллергическую реакцию. Для установления in vitro модели H2O2-индуцированного окислительного стресса HaCaT-клетки были подвергнуты воздействию H2O2 в концентрациях от 50 до 500 мкМ. Жизнеспособность клеток была оценена с помощью анализа MTS, который показал дозозависимое снижение жизнеспособности клеток, с 47% жизнеспособностью клеток при 250 мкМ H2O2. Следовательно, эта концентрация была использована в последующих экспериментах для изучения ингибирующего воздействия EEA и PA на окислительный стресс. Лечение EEA показало, что концентрации от 0,05 до 1% значительно увеличили жизнеспособность клеток, что было независимым от дозы. Аналогично, PA также показал значительное увеличение жизнеспособности клеток при всех концентрациях, соответствующих EEA (2,4–47,2 мкг/мл). Оценка цитотоксичности клеток EEA в клетках HaCaT показала значительную цитотоксичность при 0,4% EEA в течение 36 часов. Таким образом, 0,1% и 0,2% EEA были использованы для дальнейшей оценки эффективности. Содержание PA при этих концентрациях составляло 4,7 мкг/мл и 9,4 мкг/мл соответственно. Антиоксидантная эффективность EEA и PA против H2O2-индуцированного окислительного стресса в клетках HaCaT была оценена путем измерения уровня ROS. Предварительное лечение EEA и PA значительно снизило уровень флуоресценции, указывая на их эффективность в снижении продукции ROS внутри клеток. Кроме того, 0,2% EEA и соответствующая концентрация PA показали эффекты, аналогичные кверцетину, хорошо известному антиоксиданту.
Эффективность антиоксидантных ферментов SOD и CAT в HaCaT-клетках
Антиоксидантные ферменты, супероксиддисмутаза (SOD) и каталаза (CAT), вместе с общим малоновым диальдегидом (MDA) как показателем окислительного повреждения, являются установленными маркерами для оценки антиоксидантной эффективности. Их уровни значительно изменяются при индукции окислительного стресса H2O2. Для определения потенциала EEA и PA в смягчении H2O2-индуцированного клеточного окислительного стресса мы измерили общий уровень MDA и активность SOD и CAT с использованием наборов ELISA. В группе H2O2-индуцированного окислительного стресса общий уровень MDA значительно повышался с 0,736 ± 0,14 мкМ до 1,04 ± 0,52 мкМ по сравнению с контрольной группой. Однако предварительное лечение EEA и PA значительно снизило общий уровень MDA. Одновременно активности антиоксидантных ферментов SOD и CAT, которые были значительно снижены в результате воздействия H2O2, были значительно увеличены после предварительного лечения EEA и PA. Эти результаты свидетельствуют о мощных антиоксидантных свойствах EEA и его активного компонента PA.
Ингибирование цитокинов и гистамина при помощи EEA и PA в клетках HMC-1
Цитокины и гистамин в развитии аллергических заболеваний кожи
Воспалительные заболевания кожи часто связаны с реакцией гистамина и цитокинов, выделяемых мастоцитами. Для изучения антигистаминного и противовоспалительного действия EEA и PA в клетках HMC-1 были оценены уровни цитокинов и гистамина при стимуляции PMACI. Экспрессия мРНК и белка противовоспалительных цитокинов IL-8, IL-6, IL-1 и IFN-γ значительно возрастала под воздействием PMACI по сравнению с контрольной группой. Однако предварительное воздействие EEA и PA существенно подавляло выработку цитокинов под воздействием PMACI. Относительно уровней гистамина было установлено, что EEA и PA вызывают аналогичное подавление его выработки под воздействием PMACI при всех исследуемых временах предварительного воздействия.
Противовоспалительное действие EEA и PA при ингибировании цитокинов, индуцированных TNF-α/IFN-γ, в клетках HaCaT
Клетки HaCaT, тип человеческих кератиноцитов, спонтанно вырабатывают хемокины, играющие роль в иммунном ответе и воспалении. Индукция воспаления с помощью смеси TNF-α/IFN-γ приводила к значительному увеличению уровней цитокинов и хемокинов в клетках HaCaT. Предварительное воздействие EEA и PA существенно снижало уровни IL1β, IL-6, TARC и MDC. Эти результаты указывают на антивоспалительные свойства EEA и PA, эффективно модулирующие уровни воспалительных цитокинов и хемокинов в ин витро модели воспаления клеток HaCaT.
Защитные свойства EEA и PA при ингибировании дисфункции защитного барьера кожи, индуцированной SDS, в клетках HaCaT
Сульфат натрия (SDS) используется для индукции дисфункции защитного барьера кожи. Для определения защитных свойств EEA и PA был проведен анализ их воздействия на клетки HaCaT, подвергнутые воздействию SDS. Обнаружено, что как EEA, так и PA оказывали значительные защитные эффекты против цитотоксичности, вызванной SDS. Кроме того, обнаружено увеличение экспрессии генов, связанных с защитным барьером кожи (FLG и CASP14) под воздействием EEA и PA.
Модуляция экспрессии генов при аутоиммунных и воспалительных реакциях EEA и PA в клетках HMC-1 и HaCaT
Используя технологию NanoString, был проведен анализ профиля экспрессии генов в клетках HMC-1 для выявления влияния EEA и PA на экспрессию генов в условиях индукции воспаления PMACI. Обнаружено, что EEA и PA снижали экспрессию генов, связанных с воспалением и аутоиммунными реакциями, в том числе цитокинов и хемокинов. Ключевым результатом было обнаружение значительного увеличения экспрессии гена TBX21, играющего важную роль в регуляции воспаления и дифференциации Th1-клеток.
Заключение
Таким образом, наши результаты демонстрируют, что EEA обладает перспективными антивоспалительными и противозудными свойствами в клетках HMC-1 и HaCaT. Это указывает на потенциальные приложения в лечении состояний, связанных с воспалением и зудом кожи.
Обсуждение
Исследование терапевтического потенциала растения Erigeron annuus в управлении воспалением и зудом кожи
В проведенном исследовании был изучен терапевтический потенциал Erigeron annuus (EA) и его основного активного компонента - пиромеконовой кислоты (PA) - в управлении воспалением и зудом кожи, связанными с такими состояниями, как псориаз, экзема и атопический дерматит. Ранее исследования в основном сосредотачивались на применении топических кортикостероидов и антигистаминных препаратов для лечения, хотя они эффективны в определенной степени, но ограничены в своей эффективности против не-гистаминергического зуда и имеют риск побочных эффектов, таких как атрофия кожи и гиперпигментация при продолжительном использовании. Мы стремились исследовать антигистаминные, противовоспалительные и антиоксидантные свойства водного экстракта E. annuus (EEA) и PA. На основе результатов, полученных с использованием как гуманных мастоцитов (HMC-1), так и кератиноцитов (HaCaT), мы представили доказательства эффективности EEA и PA в смягчении окислительного стресса и воспалительных ответов, что предлагает многообещающую растительную альтернативу для управления состоянием кожи и воспалительными процессами.
Антиоксидантные свойства экстракта Erigeron annuus
Мы исследовали антиоксидантные свойства экстракта Erigeron annuus без корней, что отличается от предыдущих исследований, которые часто использовали определенные части растения или этанольные экстракты. Предыдущие исследования подчеркивали наличие фенольных компонентов, таких как апигенин, кверцетин-3-O-глюкозид и кофейная кислота в EA, известных своими антиоксидантными эффектами. Мы обнаружили высокую антиоксидантную активность в EA, согласно предыдущим исследованиям. Интересно, что мы использовали три различных метода экстракции и обнаружили, что холодная водная экстракция при 30 °C была наиболее эффективной для получения высокой концентрации пиромеконовой кислоты (PA), основного индикатора, который мы анализировали. Наши результаты продемонстрировали, что как E. annuus экстракт (EEA), так и пиромеконовая кислота (PA) значительно смягчали окислительный стресс, вызванный H2O2, в кожных клетках. Это подтверждалось улучшением жизнеспособности клеток, снижением производства ROS и восстановлением ключевых антиоксидантных ферментов, таких как SOD и CAT. Эти результаты подчеркивают мощные антиоксидантные способности EEA и PA, предлагая многообещающие перспективы для защиты кожных клеток от окислительного повреждения.
Антигистаминные и противовоспалительные эффекты экстракта Erigeron annuus
Мы использовали клеточные линии HMC-1 и HaCaT, которые широко признаны своей важностью в исследованиях цитокинов, связанных с воспалением и зудом кожи. Эти клеточные линии необходимы для изучения факторов, вызывающих воспалительные ответы, таких как выделение гистамина из мастоцитов, главного фактора, способствующего воспалению и зуду при атопическом дерматите. Наше исследование вносит вклад в эту область знаний, демонстрируя, что экстракт Erigeron annuus (EEA) и пиромеконовая кислота (PA) оказывают значительные антигистаминные и противовоспалительные эффекты на клетках HMC-1 и HaCaT. В частности, мы наблюдали выраженное подавление производства цитокинов и гистамина, вызванного PMACI. Более того, TNF-α/IFN-γ индуцированные противовоспалительные цитокины (IL-1β и IL-6) и хемокины (TARC и MDC) были эффективно снижены EEA и PA в клетках HaCaT. Наши результаты об антигистаминных и противовоспалительных эффектах EEA и PA согласуются с документированными пользами экстрактов Artemisia herba-alba в модуляции метаболизма глутатиона, что приводит к снижению производства ROS и усилению противовоспалительных эффектов. Эти результаты подчеркивают мощные антивоспалительные способности EEA и PA и выделяют их потенциал для смягчения воспаления кожи на молекулярном уровне.
Влияние на регуляцию барьера кожи и иммунный ответ
Цитокины значительно влияют на регуляцию барьера кожи, воздействуя на ключевые компоненты, такие как церамиды и барьерные белки, такие как филаггрин и лорикрин. Наши результаты показали значительное уменьшение уровней CXCL10, CXCL11 и CXCL9, которые являются частью семейства цитокинов CXC и играют важную роль в активации иммунных клеток и воспалении. Это снижение предполагает потенциальное смягчение воспалительного ответа, поскольку эти хемокины обычно участвуют в активации иммунных клеток при различных кожных состояниях. Наблюдаемое увеличение TBX21, транскрипционного фактора, известного своей роли в продукции IFN-γ, в клетках HMC-1, обрабатываемых водным экстрактом EA (EEA) и PA, предполагает потенциальное противовоспалительное действие EEA и PA, поскольку IFN-γ обычно ассоциируется с противовоспалительными ответами. Это неожиданное обнаружение указывает на потенциальное антигистаминное и противовоспалительное действие EEA и PA, что может быть благоприятно для функции барьера кожи. Дальнейшие исследования требуются для выяснения точных механизмов, участвующих в этих процессах, и подтверждения этих результатов in vivo.
Методы
Приготовление экстрактов Erigeron annuus
Для исследования был использован Erigeron annuus (EA), приобретенный в городе Чхонджу, провинция Чхунчхонгбук-до, Корея. Надземные части растения, включая цветы, листья, стебли и ветви, за исключением корней, были приобретены в сухой форме у компании Herb Village Co., Ltd., специализирующейся на поставке сырья для косметики. Идентификация растительного материала была проведена Гойей Чой, главным исследователем, доктором корейской медицины/доктором философии (Центр исследования ресурсов лекарственных растений, Корейский институт восточной медицины, Наджу-си, Республика Корея), и была предоставлена генетическая идентификация (дополнительный материал, S2). Соответствующий ваучерный образец (HAM-K043-001) был хранится в R&D центре компании Hamsoapharm. Экстракция проводилась с использованием очищенной дистиллированной воды в соотношении 40:1 (вода к сухому растительному материалу по весу). Смесь перемешивалась непрерывно при 30 °C или 90 °C в течение 8 часов. После экстракции раствор проходил фильтрацию через фильтр с порами 1 микрон, чтобы устранить частицы. После фильтрации экстракт концентрировался при пониженном давлении до получения содержания твердых веществ 10% (10 Brix). Все эксперименты и процедуры соответствуют Политике IUCN по исследованиям, связанным с видами, находящимися под угрозой исчезновения, и Конвенции о торговле видами дикой флоры и фауны, находящимися под угрозой исчезновения.
Идентификация и количественный анализ пиромеконовой кислоты методом ВЭЖХ
Количественный анализ пиромеконовой кислоты (PA) в экстрактах Erigeron annuus (экстракты холодной, горячей воды и этанола) проводился с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) системы Agilent 1260 Infinity (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA), включающей двухпоршневой насос, онлайн-деассемблер, автосэмплер и диодный массивный детектор (DAD). Хроматографическое разделение достигалось с использованием колонки Eclipse Plus C18 (4.6 × 250 мм I.D., 5 µm, Agilent, USA). Экстракт EA (5 г EA был собран и ультразвуковым образом экстрагирован с 20 мл 50% метанола в течение 20 минут, а затем с 30 мл 50% метанола, фильтровался через мембрану с порами 0,45 мкм и использовался в качестве тестового раствора. Подвижная фаза состояла из 0,1% H3PO4 в H2O (A) и ацетонитрила (B), с длиной волны детекции 270 нм и скоростью потока 0,8 мл/мин. Анализ проводился при контролируемой температуре 25 °C с использованием программы градиента, которая поддерживала 90% подвижной фазы A в течение первых 10 минут. Для каждого запуска в систему ВЭЖХ вводилось по 10 мкл как стандартного, так и тестового растворов.
Измерение активности антиоксидантов по методам DPPH и ABTS
Для оценки антиоксидантной активности экстракта EEA был проведен анализ скавенжинга радикалов DPPH (2,2-дифенил-1-пикрилгидразил) с незначительными изменениями метода, описанного в предыдущем исследовании46. Кратко, раствор DPPH готовился путем растворения 0,1 мМ DPPH в метаноле. К 0,05 мл экстракта EEA (0,05 мл (1:1, v/v)) добавляли 0,1 мМ раствор DPPH. Смесь инкубировалась в течение 30 минут при комнатной температуре в темноте. Поглощение измерялось при длине волны 517 нм с использованием спектрофотометра. Активность скавенжинга радикалов экстракта EEA вычислялась, выраженная в процентах, и сравнивалась с контролем на метаноле и стандартом аскорбиновой кислоты.
Анализ ABTS проводился для измерения антиоксидантной активности следующим образом: первоначально был приготовлен раствор 7 мМ ABTS (Sigma-Aldrich, A1888) в дистиллированной воде и хранился при 4 °C. Затем был приготовлен раствор 245 мМ APS (Sigma-Aldrich, A3678-25G) в ультрапурной воде. Для получения радикалов ABTS к раствору ABTS добавлялся APS до конечной концентрации 2,45 мМ. Смесь инкубировалась в течение ночи при комнатной температуре в темноте в течение 16 часов. Концентрация раствора радикалов ABTS измерялась при длине волны 734 нм. Подготавливался раствор 10 мМ Тролокса (Sigma-Aldrich, 238813) в метаноле. Затем 10 мкл образца или стандарта (Тролокс) смешивали с 190 мкл ультрапурной воды в ячейке микропланшеты. Пробы используются для стандартов метанола и дистиллированной воды для образцов. Смеси в ячейках встряхивали, инкубировали в темноте в течение 5 минут, и поглощение измерялось при 734 нм.
Измерение концентрации внутриклеточных ROS
Концентрация внутриклеточных ROS измерялась с помощью зонда карбокси-H2DCFDA. Клетки HaCaT (2 × 104 клеток/см2) высевались в 6-лучевые пластинки для культуры клеток на 24 часа, предварительно обрабатывались экстрактом EEA (0,1% или 0,2%) и PA (соответствующие концентрации, 4,7 и 9,4 мкг/мл) в течение 6 часов и стимулировались 250 мкМ H2O2 в течение 12 часов. Клетки дополнительно инкубировались с 10 мкМ карбокси-H2DCF-DA в течение 20 минут. После инкубации клетки промывались 1× PBS, и изображения захватывались с помощью микроскопа Olympus IX53 (Olympus).
Измерение перекисного окисления липидов и активности антиоксидантных ферментов
Для изучения воздействия EEA на ответы на окислительный стресс клетки HaCaT предварительно обрабатывались различными концентрациями EEA в течение 6 часов, а затем перекисным окислением водорода (H2O2) в течение 12 часов для индукции окислительного стресса. Клетки затем собирались для дальнейшего анализа. Общий малоновый диальдегид (MDA), супероксиддисмутаза (SOD) и каталазная активность (CAT) анализировались в соответствии с рекомендациями DogenBio (Сеул, Корея).
Условия культивирования клеток
Клетки человеческих эпидермальных кератиноцитов (HaCaT) культивировались в модифицированной среде Дульбекко (DMEM, LM001-05; Welgene) с добавлением 10% плазмы плодового бычка (FBS, Gibco, Carlsbad, CA, USA), 1% пенициллина и стрептомицина (P/S, GIBCO) при 37 °C во влажной камере с 5% CO2. Клетки человеческих мастоцитов (HMC-1) также культивировались в тех же условиях, используя модифицированную среду Дульбекко Искове (IMDM, LM004-01; Welgene).
Оценка жизнеспособности клеток с использованием реагента EZ-Cytox
Для измерения жизнеспособности клеток HaCaT и HMC-1 использовался реагент EZ-Cytox (EZ-1000, Dogenbio). Клетки HaCaT (1 × 104 клеток/см²) и HMC-1 (1 × 105 клеток/мл) высевали в 96-луночные планшеты на 24 часа. Поскольку клетки HMC-1 представляют собой клетки в суспензии, обработка образцов начиналась непосредственно через 30 мин после посева. Затем клетки предварительно обрабатывали различными концентрациями (0,05–1%, концентрации экстрактов были разведены на основе 10 бриксов ЭЭА) ЭЭА в течение 24 и 48 часов. После инкубации в каждую лунку добавляли по 0,01 мл реагента EZ-Cytox и инкубировали в течение 2 часов. Затем абсорбция в каждой лунке измерялась на 450 нм с помощью микропланшетного считывателя.
Формирование клеточных моделей воспаления и повреждения кожного барьера
Для индукции воспалительного ответа в клетках HMC-1 они обрабатывались смесью 50 нМ PMA и 1 мкМ A23187 (PMACI) и индуцировались в течение 24 часов PMACI после 1-часовой предварительной обработки ЭЭА и ПА; для гистамина измеряли ингибирование секреции гистамина после 1, 6 и 12 часов предварительной обработки ЭЭА и ПА соответственно. Клетки HaCaT индуцировали воспалительный ответ смесью 10 нг/мл TNF-α и 10 нг/мл IFN-γ, который индуцировался в течение 24 часов после 6-часовой предварительной обработки образцов. Для формирования клеточной модели дисфункции кожного барьера использовались различные концентрации додецилсульфата натрия (SDS) в течение 24 часов, и концентрация, при которой клеточная жизнеспособность составляла 60%, была выбрана для последующей обработки в течение 24 часов после 6-часовой предварительной обработки ЭЭА и ПА для создания модели дисфункции кожного барьера.
